精子介导的基因转移概述

2019-08-23 13:22 来源:未知

核心提示:精子介导转基因动物的制备高华颖 ,曹 阳,李世辉,任 艳,李庆伟摘 要:采用直接注射的方法,将脂质体包裹的含人乳铁蛋白基因的

核心提示:随着DNA内部结构和遗传机制的揭示,生物学家们不再满足于探索揭示生物遗传的秘密,而是去设想改变生物的遗传性状,创造已经消随着DNA内部结构和遗传机制的揭示,生物学家们不再满足于探索揭示生物遗传的秘密,而是去设想改变生物的遗传性状,创造已经消失的物种或者改变人类自己。科恩把两栖动物的基因在细菌内发挥作用,成为世界上第一个拥有基因工程技术专利的人。首次打破了亿万年的天然屏障。自Palmiter等获得了第一只转基因小鼠以来,转基因猪、牛、羊、鱼等先后获得了成功。他们都获得了人类期望的遗传性状。1997年以来,我国科学家章怀云等人以草鱼精子与红鲤鱼肝脏,总RNA共培养,再与草鱼卵受精,获得了体形、体色变异的新个体。现在已经成功把人的FⅧ基因通过精子载体介导在转基因小鼠体内表达。这些发现对于人类改造生命,创造新的物种,提供了大量的经验和资料。创造新物种,培育动物新品种,为人类的生存考虑,适应日益变化的全球环境问题已经是一个正在思考的问题。将外源基因导入基因组的转基因技术是现代生命科学中的一项重要技术,它不仅广泛的应用于研究基因的功能,也已用来快速改变的改变生物的遗传性状、创造自然界没有的物种。在动物上,常用的转基因方法包括显微注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞法。显微注射法的主要缺点是操作比较繁琐,对技术、设备要求高,易对胚胎造成机械性损伤,而且DNA整合效率较低;反转录病毒感染法虽增加了DNA整合效率,但反转录病毒基因组的大小受到限制,且易将病原体基因序列引入诉诸基因组中;胚胎干细胞法则工作量巨大,筛选出转基因后代的周期较长。近几十年发展起来精子介导的转基因技术,以精子作为外源基因的载体,在受精过程中将外源基因导入动物胚胎,从而使外源基因进入子代的基因组中。这种方法一经问世就以其操作简便、成本低廉、便于大量筛选等优点而受到人们的重视。外源基因与精子细胞的互作是由一些特异的因子调控的过程;精子结合外源基因的能力已经在许多物种中得到证明。同时在很多物种中,利用精子介导得到了后代遗传性状的改变。随着对精子介导的深入研究,特别是在提高转基因的表达率方面取得突破后,这一方法可望成为转基因技术和创造新物种的重要手段。广大研究者认为认可的生产转基因动物的基本方法有三种,即DNA显微注射法、反转录病毒载体法以及利用转化的全能胚胎干细胞形成生殖系嵌合体的基因转移。目前这三种方法制作转基因动物的效率还很低,寻求一种简便高效可广泛应用于各种哺乳动物、鸟类、鱼类的转基因方法仍是必要的。精子载体法提供了一条新的基因转移途径。这种方法几乎可以在所有动物上应用,成本低、效率高,对卵原核无损害,符合生理受精过程。Maione利用人工授精程序就可以生产转基因动物。1971年,Brackett等开始了精子介导外源DNA转移的先驱工作:当兔子精子暴露于纯化的SV40-DNA中后,在镜子的头部检测到放射性物质。他们的结果表明异源的DNA分子可以结合进入哺乳动物的精子,在2-细胞胚胎期检测到这些DNA,说明这些精子在受精过程中能将外源DNA携入卵细胞。意大利学者Lavitrano等在小鼠上进行的研究,他们将获得的小鼠附睾精子与线粒体或环状pSV2CAT质粒一起37℃孵育30分钟后,再与成熟卵子进行体外受精,这样得到胚胎在2-细胞期移植入受体鼠的输卵管内,在受体鼠产出的250只体外受精有30﹪为阳性个体。从一只阳性小鼠总DNA构建的基因组文库中重新克隆了pSV2CAT,并且对该克隆HineⅡ的两条酶切片段的核苷酸序列测定验证了杂交信号本质上pSV2CATDNA。试验还发现阳性个体中转入的基因可以稳定的整合入生殖细胞系,而且在转基因家系的后代个体的组织器官中,特别是在尾组织和肌肉组织中可检测到CAT基因的表达。于健康将金鱼精子与线性DNA一起保温30分后用于受精,得到转基因金鱼。王红军研究将报告基因LacZ转入兔卵母细胞中。在胚胎发育到8~16细胞阶段以及桑椹阶段进行组织化学染色,发现LacZ基因在早期胚胎中可以表达,阳性率为55.62﹪.将发育至2~4细胞阶段的胚胎移植到同期发情的受体母兔的输卵管中,在母兔妊娠15天,剖开子宫取出成形仔兔23只,进行组织化学染色,检测出报告基因LacZ在5只仔兔中表达。Rottman对精子载体法进行了改进,外源DNA在与兔精子混合培养之前先用脂质体包裹,脂质体自发的与DNA相互作用形成脂质体-DNA复合体。这种复合体比较容易和子细胞质膜融合,从而进入细胞内部,同时脂质体的包裹还可以防止核酸酶的降解以及防止DNA被稀释。经过与兔精子共孵育,人工授精,得到49只仔兔,经过Southern和PCR分析,其中31只为阳性。同时Squires应用这种改良的精子载体法在转基因鸡生产上获得满意结果。对12胚龄的鸡胚应用Southern印迹杂交检测发现阳性率高达15﹪~25﹪,最理想的一次试验阳性率高达92﹪,如此高的阳性率是显微注射法无法比拟的。显微注射法阳性率为1﹪~3﹪.通过以上科学实验可以看到精子介导的转基因技术为人类改变自己和创造新物种提供了可行的方案之一,可以预测,从基因开始进行依照人的意愿进行的物种改造,在现有的技术条件下已经得到较好的发展,创造新物种的夙愿在科技迅速发展的今天是可以实现的,只要人类找到了合适的途径和方法遵循学科规律,广泛集结各种影响物种生存的因素,相互交流,开辟思路,新物种的创造只是时间问题。

据介绍,在当前制备转基因动物的各种技术方法中,大多数技术在操作过程中需要昂贵的仪器设备和相当熟练的技术人员,因而投资大、周期长,这在客观上限制了转基因动物生产的可操作性。在这种情况下,邓继先领衔的课题组设计了不同的研究路线,系统研究了体细胞基因打靶、BAC载体法、精子载体法等技术在转基因动物中的应用,并取得了一定的研究成果。其中,精子载体法的研究取得了非常有价值的进展。课题组潘庆杰博士和沈伟博士利用精子载体法制备了乳腺生物反应器的转基因兔模型,获得F1代转基因兔184只,通过鉴定发现,转基因阳性后代89只,阳性率48.4%。其中,新发明的DMSO法获得转基因阳性率达到56.2%。

摘 要:采用直接注射的方法,将脂质体包裹的含人乳铁蛋白基因的重组质粒pLNCXHLF 注入兔睾丸组织和羊输精管中,一个月后分别与正常雌兔及正常的母羊交配。所产仔兔均为活体,经PCR 和Southern 检测,转基因仔兔阳性率平均为35 % ;羔羊经引物F1/ R1 系统PCR 检测阳性率为33. 3 % ,F2/ R2 系统PCR 检测阳性率为25 % 。将流产羔羊组织解剖后提取舌、肺、肝脏、肌肉、皮肤、脑、生殖腺、脾脏、小肠、心脏、肾脏共11 种组织的总DNA 进行PCR 检测,发现:F1/ R1 和F2/ R2 系统PCR 检测出阳性信号存在于不同组织;F2/ R2 PCR 系统检测阳性信号较F1/ R1 PCR 系统少;而且各种组织的外源DNA 存在的拷贝数不等,造成阳性信号的强弱程度不同。结果表明:1) 脂质体包裹外源基因转染精子的方法,可将外源基因导入受精卵,并得到了较高的转基因阳性率;2) 精子携带外源DNA 的整合过程是随机的,在受精过程和胚胎早期分化过程中可能发生了片段丢失、不完全整合或游离于基因组存在而产生嵌合体。本文的研究结果证明了该方法是一种简捷有效的新途径,为进一步深入探讨精子介导转基因动物制备可行性奠定了基础,给精子载体法制备转基因哺乳动物研究提供了有价值的参考。关键词:精子;脂质体;转基因动物

动物乳腺生物反应器,是通过制备转基因动物并且利用它们的乳腺,大规模生产供人类疾病治疗和保健用的药用蛋白或其它生物活性物质。转基因动物的乳腺可代替细菌和细胞等生物发酵,并且可以有效地对所产出的蛋白质进行后加工和修饰。因而,动物乳腺生物反应器被国际上公认为是转基因动物研究中最具有发展前景的方向之一,也是实现基因工程制药极富诱人前景的重要途径。

精子介导转基因动物的制备高华颖 ,曹 阳,李世辉,任 艳,李庆伟

www.8522.com,这项研究由中国军事医学科学院邓继先研究员主持,山东莱阳农学院、东营市天翼生物技术公司等有关科研、生产单位的相关人员共同参与完成。

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澳门新萄京8522,新华网济南3月25日电从山东省东营市农科所获悉,被列入国家“863”计划项目的转基因动物研究项目“动物乳腺生物反应器”研究,近日取得重要成果。课题组制作的转基因兔于2004年1-2月份在当地一养殖场内陆续诞生。经最新检测,新生的184只小兔中,阳性个体为89只,阳性率达到48.4%,其转基因效率和转基因动物数量均获得重大突破。

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