质粒图谱的阅读

2019-08-25 14:26 来源:未知

核心提示:载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一、一个合格质粒的组成要素复制

核心提示:载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一、一个合格质粒的组成要素复制

核心提示: 近年来Qiagen公司无论在分子诊断方面,还是核酸、蛋白纯化方面都有出色的表现。在分子诊 近年来Qiagen公司无论在分子诊断方面,还是核酸、蛋白纯化方面都有出色的表现。在分子诊断这一块,根据Kalorama Information网站自2003年的统计,它作为分子诊断公司世界排名第九。在今年5月31号,它收购了artus公司,这是一家针对病原体、基因型和药物基因组学测试提供基于聚合酶连锁反应 分子诊断公认的领导厂商,估计它作为分子诊断学公司的排名还将继续攀升。在核酸、蛋白纯化这方面,Qiagen分别在6月中旬和下旬收购了北京天为时代和Nextal生物科技公司,而Nextal是一家研究蛋白质晶体学的公司,他们拥有一套体系可以简化制备用于蛋白质晶体成像的蛋白的过程。它的加入为Qiagen在蛋白质研究这一块注入了新鲜的血液。 用基因工程的手段表达蛋白质,必需经过纯化才能实现最终目的。不同性质的蛋白质纯化条件各不相同太难摸索,这一点和核酸相差甚远,所以将目的蛋白和一个亲和纯化标签融合表达,通过亲和纯化Tag蛋白来纯化目的蛋白,就成为常用的迂回手段。大的Tag最后要经过切割得到目的蛋白,而His-Tag,这个只有6个组氨酸大小的标签在pH8.0时不带电,很小,几乎没有什么免疫原性,经多种融合蛋白验证对蛋白的分泌、折叠和结构,甚至功能几乎没影响,可以放在C端或者N端,更重要的是能够高度亲和Ni离子――而固化金属离子亲和层析已经相当成熟。所以融合蛋白纯化方便,HisTag得到越来越广泛应用。 Qiagen公司的原核表达产品设计的概念非常明确,所有表达载体都是围绕在纯化中应用最为广泛的组氨酸纯化标签设计的――因为Qiagen公司有纯化6×组氨酸而专门设计的专利产品氮川三乙酸镍(nickel-nitrilotriacetic acid,Ni-NTA)金属亲和层析填料。这种NTA填料独有4个金属螯合位点(而普通填料只有3个位点),能更牢固定Ni离子,避免其他同类填料容易在清洗过程中因固定不牢离子脱落而造成的产物回收率低等问题。也因为这个专利,Qiagen还替其他品牌代工生产Ni-NTA纯化填料。Qiagen公司的QIAexpress System纯化系统提供了许多优点是其它纯化系统无法比拟的。

载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。

载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。

特点 优势
6×组氨酸与Ni-NTA的结合是不受构象影响的 在天然或变形的条件下进行一步纯化
使用的是温和的洗脱液环境 结合、洗涤和洗脱步骤不会对蛋白结构产生影响
6×组氨酸标签比普通的标签要小得多 纯化后蛋白可以直接进行下游操作6×组氨酸可以用于任何表达系统,包括:细菌、杆装病毒和哺乳动物
6×组氨酸标签在生理溶液pH下不带电荷 标签不会干涉重组蛋白的结构和功能6×组氨酸不会影响蛋白的分泌
6×组氨酸标签免疫原性差 重组蛋白可以不需要出去标签直接作为抗原进行免疫
利用Xa因子蛋白酶可以方便地将6×组氨酸标签有效地切除 去除标签的蛋白可以用作晶体成像或者核磁共振研究
一些QIAexpress载体带有6×组氨酸二氢叶酸还原酶标签(6×His-DHFR) 融合在6×组氨酸DHFT标签中的小肽段在表达时有助于保持稳定 6×组氨酸DHFR标签在小鼠和大鼠中的免疫原性不高,所以与之融合的重组蛋白不需要把标签切除,可以直接进行免疫或者表位测图

一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因 可以便于加以检测,如Amp ,Kan 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段P/E 启动子/增强子Terms 终止信号加poly信号 可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。tetr 可以阻止四环素进入细胞。camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。neor 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418失活hygr 使潮霉素β失活。第三步:看多克隆位点。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号启动子-促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子,负调控序列。核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG和SD序列。转录终止顺序/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly加尾信号。回答有人之前提出的一个问题:为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针,那其实是代表两条DNA链,即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上.三、介绍一下关于载体的知识1.什么是载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞,需要运载工具携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体。P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子,是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA2.载体的分类―――按功能分成:克隆载体 都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段的载体。(所以有时实验时扩增效率低下,要注意是不是使用的严谨行载体)表达载体 具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。―――按进入受体细胞类型分:原核载体 真核载体 穿梭载体(sbuttle vector) 指在两种宿主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间).P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子,以确保两类细胞中都能扩增。3.基因工程载体的3个特点:都能独立自主的复制:载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域,如MCS,插在其中的外源DNA片段,能被动的跟着载体一起复制/扩增,就像载体的正常成分一样。都能便利的加以检测: 如载体的药物抗性基因,多是抗生素抗性基因,将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时,只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。都能容易进入宿主细胞中去,也易从宿主细胞中分离纯化出来。4.载体的选择和制备:选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点:构建DNA重组体的目的,克隆扩增/表达表达,选择合适的克隆载体/表达载体。.载体的类型:克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小。如<10kb选质粒。表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。对原核表达载体应该注意3点:①选择合适的启动子及相应的受体菌;②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不产生阅读框架错位。选用质粒做载体的4点要求:①选分子量小的质粒,即小载体→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多;②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个。③必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;④必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr。无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割,获得分子,以便于与目的基因片段进行连接。

一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因 可以便于加以检测,如Amp ,Kan 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段P/E 启动子/增强子Terms 终止信号加poly信号 可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。tetr 可以阻止四环素进入细胞。camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。neor 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418失活hygr 使潮霉素β失活。第三步:看多克隆位点。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号启动子-促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子,负调控序列。核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG和SD序列。转录终止顺序/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly加尾信号。回答有人之前提出的一个问题:为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针,那其实是代表两条DNA链,即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上.图片 1

QIAexpress系列都是用pQE载体进行的,作为德国出品的东西,它具有德国人一贯的严谨性,各方面都考虑得比较周全。pQE载体都是以T5启动子起始转录-翻译系统的,pQE 是pDS家族的一员,来源于pDS56/RBSII和pDS781/RBSII-DHFRS。这些低拷贝质粒都有以下特征:

  • 优化的启动子-操纵元模式,包括来自噬菌体的T5启动子(由大肠杆菌的RNA聚合酶识别)和两个乳糖操纵子识别序列,以保证与乳糖抑制子的结合从而抑制T5启动子的表达。
  • 合成的核糖体结合位点RBSⅡ,保证高效的翻译
  • 在克隆区域的5'或者3'含有6×组氨酸标签
  • 有多个终止密码子,无论你的片段从多克隆位点的哪里插入都可以正确的终止。
  • 两个强而有利的转录终止子:来自λ噬菌体的t0和来自大肠杆菌rrnB操纵元的T1,可以有效预防转录中的通读现象并保证表达质粒的稳定性。
  • 所有质粒含有β- 内酰胺酶基因,因此氨苄霉素抗性,在t0和T1间插入有氯霉素乙酰化转移酶基因(chloramphenicol acetyl transferase gene,CAT),这个基因不带有启动子,通常不会被表达。根据菌株和载体的不同,会有少量的CAT活性被检测到。
  • ColE1复制起点
  • pQE-TriSytem不含有CAT盒并利用pUC的复制起点,此载体含有三个启动子,可以分别在大肠杆菌、杆状病毒和哺乳动物中进行表达

Qiagen表达载体的分类可以根据加入的标签的种类、位置以及利用何种蛋白酶进行标签切割来分类。

  1. 在N末端加入标签这一系列载体的N末端加有标签,其中pQE-30、pQE-9带有6×组氨酸标签,pQE30系列中的三个载体的多克隆位点距离其实密码子而个相差一个碱基,pQE-9则是在多克隆位点处的设计较简单。PQE40则是带有6×组氨酸二氢叶酸还原酶标签(6×His-DHFR),对于比较难表达的蛋白以及蛋白太小容易被降解的蛋白可以利用这种标签。它可以保证蛋白的稳定性,同时不会对外源蛋白的免疫原性造成很大的影响,非常适合用于表位筛选。
  2. 在C末端加入标签在蛋白的C末端加入标签的好处是显而易见的:可以利用基因本身的ATG作为起始密码子,保证了蛋白天然的N末端,这对于一些医药用的重组蛋白是相当重要的;同时可以纯化出那些完整表达的蛋白,一些在翻译过程中容易造成“暂停”现象的蛋白就不用怕纯化产物里含有不完整的产物。融合了6×组氨酸标签的有pQE-60和pQE-70,融合了6×His-DHFR的有pQE-16。
  3. 顺式抑制载体pQE系列的表达载体一般情况下需要在M15菌株中进行表达的,但是设计的pQE80L系列就没有这种约束,它可以在任意大肠杆菌株中进行表达。这与一般的pQE载体利用M15中质粒pREP4的反式lacI抑制子调控不同,它是利用顺式lacIq调控产生大量lac抑制子从而在加入IPTG诱导前起到阻遏蛋白表达的作用。阻遏外源蛋白的本底表达对于那些含有毒性的蛋白来说是十分重要的。
  4. 多系统表达载体pQE-TriSystem载体含有大肠杆菌的T5启动子,哺乳动物的CAG启动子和杆状病毒的p10启动子。因此它可以同时在三个系统中进行表达。这与Invitrogen的Gateway技术有异曲同工之妙,它在操作上比Invitrogen的Gateway还要方便,因为Gateway技术在构建入门克隆后与每个载体仍需一次重组反应。His・Strep pQE-TriSystem含有两个蛋白标签,分别是6×组氨酸标签和短的Strep-标签Ⅱ。利用这两个标签,可以用Ni-NTA和Strep-Tactin填料进行两步纯化,这样分离的蛋白可以最高纯度可以达到98%。而且操作也十分方便,将裂解后的上清先上到Ni-NTA柱,然后用咪唑将蛋白洗脱,之后可以直接把洗脱液上到含有Strep-Tactin的柱子进行纯化。这两者间的顺序可以互换。
  5. 含有切除标签蛋白酶切位点载体Qiagen提供两种可以切除组氨酸标签的方式,一种是利用DAPase的TAGZyme系列,另外一个就是利用Xa因子的Xa系列。TAGZyme系统的主要组成部分是一种外切蛋白酶――二肽氨基肽酶Ⅰ(dipeptidyl aminopeptidase I,DAPase),如果你表达的外源蛋白不含有外切酶识别的停顿位点,那么你还需要联合使用谷氨酸循环转移酶(glutamine cyclotransferase,Qcyclase)和焦谷氨酸氨基肽酶(pyroglutamyl aminopeptidase,pGAPase)。这些酶都经过重组,可以通过Ni-NTA填料除去。应用TAGZyme系统的反应是十分灵敏的,不会存在有内切的现象,并且切割效率高,一些灵敏的蛋白可以在4℃进行反应,最大程度地防止了蛋白地降解。这个系列有两个载体,当你的外源不含有DAPase停顿位点的时候可以使用TAGZyme pQE-1,它可以在你的外源蛋白前面人工加入停顿位点谷氨酸残基,之后利用Qcyclase将它转成焦谷氨酸成为一个外切酶的停顿位点。对于那些外源蛋白中已经含有外切酶停顿位点的,可以选用TAGZyme pQE-2。另一种可以利用蛋白酶出去组氨酸标签的是pQE-30 Xa载体,它是在pQE-30载体上构建起来的,在6×组氨酸和外源蛋白之间含有一个Xa因子蛋白酶识别位点,Xa因子可以从识别位点的精氨酸后准确将外源蛋白分离而不带有任何载体加入的氨基酸。之后Xa因子蛋白酶可以利用树脂分离出来。
  6. 含有双标签载体pQE-100 DoubleTag是带有两个标签的载体,除了在N末端的6×组氨酸外,在C末端还有12个来自哺乳动物MAP激酶2的氨基酸构成的Tag・100。当蛋白的组氨酸端利用Ni-NTA填料固定住的时候,另一端暴露的Tag・100可以被抗体检测。这样在进行ELISA、药物和蛋白定量等筛选过程时就非常方便。

以上就是Qiagen载体这块的基本情况,当然原核表达还有一个重要的因素,就是表达菌株。一般情况下pQE系列载体建议在M15菌株中进行表达。M15含有卡那霉素抗性的质粒pREP4,同时它带有表达lac抑制子的基因,可以高效表达lac抑制子,紧紧地阻遏着外源蛋白的表达。它利用p15A复制元,可以与ColE1复制起点的质粒载体兼容。在利用M15表达效果不好的时候可以考虑SG13008[pREP4]菌株,它和M15同样是来源于K12的衍生菌株。 一些lacq突变的菌株,例如:XL1 Blue,JM109和TG1,可以制造足够的lac抑制子有效的阻断转录,是储藏并繁衍pQE质粒的理想菌株。这些菌株也可以作为表达无毒害蛋白的宿主菌,但是它们的表达效率可能比M15要低,同时控制程度也没有M15那么严谨。 Qiagen的表达菌株也具有抗性,这样就保证了在加入IPTG诱导前不会有任何外源蛋白的本底表达,因为如果菌株在传代过程中失去了pREP4,也就丧失了卡那抗性,因此会被抗生素消灭掉,剩下的都是含有抗性和lac抑制子的细菌。虽然这个设计会给我们带来一定的麻烦并提高培养基的成本,但是在菌株培养过程中难免会有突变产生或者实验室污染情况,如果你不幸挑到无法紧密调控的菌株你可能很久就困在这个应该是非常simple的实验里了。其它品牌的表达菌株很少会设计抗性,这让我们再一次见识了“Made in Germany”的一丝不苟。

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