感受态细胞常用的制备方法

2019-08-25 14:26 来源:未知

核心提示: 本实验学习将质粒DNA分子转入大肠杆菌的方法及如何筛选带有质粒DNA的细胞克隆,即转化子。 受体菌Ec

核心提示: 常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA,,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

核心提示:DNA的酶切与连接 酶切反应 同质粒DNA的鉴定,只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切,则成比例增加。DNA的酶切与连接

本实验学习将质粒DNA分子转入大肠杆菌的方法及如何筛选带有质粒DNA的细胞克隆,即转化子。

常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA,,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞 。

酶切反应

受体菌Ecoli RRI 在低温条件下经Ca 处理,可改变细胞膜的通透性,利于受体菌对DNA的摄取,这种经Ca 处理的细菌称感受态菌。pBR322 质粒带有氨基苄青霉素和四环素基因,如将pBR322质粒转入到对上述抗生素敏感的Ecoli RRI菌体内,则可使该细菌获得Apr和Tcr,表现出对Ap和Tc的抗药性。

转化,是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

同质粒DNA的鉴定,只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切,则成比例增加。

感受态菌的制备

α-互补现象:因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息,编码α-互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补。当这种载体转入可编码?-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基-?-D硫代半乳糖苷的诱导下,宿主可同时合成这两种肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α-半乳糖苷酶能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷而产生蓝色的菌落,所以利用这个特点,在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个外源DNA时,会造成LacZ基因的失活,破坏α-互补作用,就不能产生具有活性的酶。所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。

加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀,-20℃2h以上。

1.菌株 E.coli RRI 2.LB 液体培养基 3.75mM Cacl2 4.其它:灭菌小试管、刻度吸管、微量加样器、离心机

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法 :方法一: 细菌转化的方法多以Mendel和Higa的发现为基础,其基本方法是用冰预冷CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌,使之进入感受态得以转化。用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞,常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株,且迅速、重复性好。实验步骤:1、 从37℃培养16~20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52),或1ml新鲜的16~20h过夜培养物,转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2~3h(旋转摇床200~300r/min),每隔20~30min测量OD600值≈0.4。2、 在无菌条件下将细菌转移到一个,用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中,在冰上放置10~20min。 3、 于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。4、 倒数培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。 5、 以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀,放于冰上。6、 于4℃用SorvallGS3转头以4000r/min离心10min,以回收细胞。7、 倒出培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。8、 每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用。9、 用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中,每管加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl,DNA≤50ng),轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min。10、 将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上,放置90s~2min,不要摇动试管。11、 快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2min。 12、 每离心管加800μlSOC培养基,用水浴将培养基加温到37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45min使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。13、 将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。14、 将平板置于室温至液体被吸收。15、 倒置平皿,于37℃培养,12~16h后可出现菌落。

15000rpm离心15min,弃上清。

1.将细菌接种于5ml LB液体培养基中,37℃振荡培养16~20h。 2.取新鲜菌液,按1/100的接种量接种于LB培养基中,37℃振荡培养2~3h。 3.取1.5ml菌液,4℃ 3000rpm/min,离心5min,弃上清。 4.菌体沉淀加入750μl预冷的75mmol/L CaCL2 溶液,轻轻吹打菌悬液,放冰浴30min。 5.4℃3000rpm/min,离心5min,弃上清。 6.菌体沉淀加入200微升预冷的75mmol/LCaCL2溶液,冰浴4min以上。4℃保存备用。

方法二: CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌,使其成为感受态细胞,便于质粒DNA的转化,可满足一般实验的要求。与CaCl2法相比具有多种优点:使用方便,只需一步即可完成感受态细胞的制备;转化效率略高于CaCl2法,一般可达106-108cfu/μg,满足一般实验需要;感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油,并且经长期保存活力无明显下降。 1、 从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个,分别接种5ml LB培养基中,37℃,250rpm, 过夜培养。 2、 次日从5ml LB培养物吸取200μl转入50ml LB培养基中(250ml 锥形瓶),37 ℃,250rpm培养2小时,此时OD600约0.4—0.5。 3、 吸取1ml菌液到1.5ml离心管里,5000rpm离心5分钟,弃去上清。 4、 加入100μl预冷的Solution A,悬浮菌体,冰浴30分钟。5、 此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。 注意事项:1、 所用器具一定要清洁;2、 操作步骤2 中培养基的装量也是很重要的,建议装量不要高于此值:500ml 锥形 瓶装100ml培养基,250ml锥形瓶装50ml培养基;3、 在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2 ,效果会更好一些;4、 为保证细胞处于对数生长期,培养后的菌体的OD值不要高于0.6;5、 制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作;6、 细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击,冰浴后直接加入新鲜LB,简化操作步骤,但转化效率低于热击方法,适用于对转化率要求不高的实验。

加入75%乙醇洗涤2次,离心弃上清,真空抽干。

质粒转化

方法三: 1、 取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中,37℃振荡培养过夜 。2、 取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中,37℃振荡培养3h至OD600=0.3。3、 然后把培养物倒入1.5ml离心管中,冰浴10min。4、 在4℃下以4000rpm离心5min,去上清液 。5、 把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中,置冰上30min 。

加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。

1.pBR322 质粒DNA, 2.感受态菌75mmol CaCl2 3.LB肉汤培养基,无药LB琼脂平板,氨苄青霉素琼脂平板 4.其它:灭菌小试管,L形玻璃棒

6、 然后再在4℃下以4000rpm离心10min,去上清液 。7、 将菌体悬浮于0.1ml CaCl2溶液中,冰浴放置4-12hr备用。

测定DNA的含量。

  1. 取2个洁净,灭菌的EP管,按表10-2加入各成分: 2. 上述2个试管充分混均匀后,置冰浴30min。 3. 42℃2min或37℃5min,立即置冰浴2min。4. 加入1ml LB肉汤培养基,37℃静止培养1h。

方法四:1、 将1ml过夜培养的细菌(如DH52、TG1、TM101)接种于100ml2×YT培养于500ml烧瓶。于37℃刷烈振荡,通常≥200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2~0.5,需2~4h。 2、 将培养物放于冰上致冷10min,于4℃离心细菌培养物,10000rpm离心10min。3、 弃除上清,将细菌悬浮于原始培养体积的一半的50mMCaCl2和10mm Tris?HCl无菌冷冻液体中。 4、 将细菌悬浮放在冰上约5min,然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。5、 弃上清,悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl和10mMTris?HCl无菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞,即可用于转化。200μl分装于无菌的1.5ml微量离心管中,贮存于-80℃冰箱中。

加入线性载体DNA和含量3~4倍于载体的待插入DNA片段,连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl,在12~14℃反应12~16h。

转化子筛选: 1.取实验组培养菌液涂布在氨苄青霉素琼脂平板上,对照组菌液分别涂布在无药LB琼脂平板和氨苄青霉素琼脂平板上,每块板涂0.1ml,用灭菌L形玻璃棒涂匀。将涂好的平板置370C培养过夜,观察转化结果。 2.E.coli 受体菌不含有质粒DNA,也不含Apr和Tcr 。在含Ap和Tc的培养基中不能生长,若实验组在含Ap和Tc的平板上出现菌落,可初步确定受体菌获得了耐药性质粒,然后再通过提取质粒DNA进一步鉴定转化子。

方法五:TSB法实验试剂:1M Mg2 ,用0.22um滤膜超滤除菌。TSB液(30mL/ 80mL菌液): PEG3350 3g ;Tryptone 0.3g ;Yeast extract 0.15g ;NaCl 0.3g ;以上 121℃, 15min 灭菌后,加入1M Mg2 600uL , 以及DMSO 3mL 实验步骤:1、 活化菌株 。2、 挑单菌落培养于5mL 的液笨培养基中。3、 取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养 。4、 370C培养3-4小时,OD600在0.4-0.6 。5、 离心,去上清 。6、 加入20mLTSB,重悬 。7、 离心,去上清 。8、 加入10mLTSB,再加入15-20%的甘油,分装保存。注:整个操作过程均应在冰上进行。所用药品均需灭菌。

连接反应液可置-20℃保存,供转化用。

方法五:TSB法实验试剂:1M Mg2 ,用0.22um滤膜超滤除菌。TSB液(30mL/ 80mL菌液): PEG3350 3g ;Tryptone 0.3g ;Yeast extract 0.15g ;NaCl 0.3g ;以上 121℃, 15min 灭菌后,加入1M Mg2 600uL , 以及DMSO 3mL 实验步骤:1、 活化菌株 。2、 挑单菌落培养于5mL 的液笨培养基中。3、 取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养 。4、 370C培养3-4小时,OD600在0.4-0.6 。5、 离心,去上清 。6、 加入20mLTSB,重悬 。7、 离心,去上清 。8、 加入10mLTSB,再加入15-20%的甘油,分装保存。注:整个操作过程均应在冰上进行。所用药品均需灭菌。

关于待插入DNA片段的获得参见附注。

大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化

1.感受态的制备

接种单菌落于2ml LB培养液中, 37℃过夜。

取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中,37℃振摇4~6h至A590=0.4~0.6。

倒入50ml管内,水浴10min,以2500~3000rpm离心5min,弃上清。

缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体,冰浴20min,同上离心弃上清。

缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中,每管200μl,冰浴1~2h。

2.重组DNA的转化

将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记,然后按下述进行:

转化项目 受体菌 DNA 总体积
DNA对照组 0 10μl 200μl
受体菌对照组 200μl 0 200μl
转化组 190μl 10μl 200μl

冰浴30min至1h。中间摇动3次,以防受体菌沉底。

42℃90s。

37℃水浴5min。

加入无相应抗生素的Lb 200μl,混匀后,37℃水浴30~60min。

分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布,室温下干燥,然后倒置于37℃温箱中培养过夜。

转化子DNA的快速鉴定-快速细胞破碎法

挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中,37℃振荡培养至A590值为0.6~0.8。

取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中,9000rpm离心9min,去尽上清。

加入70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris �CHCl10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml,加双蒸水至200ml],混匀后,37℃水浴30min以上。

15000rpm离心15min。

吸取上清点样电泳,观察。

转化子DNA的酶切鉴定

1.转化子DNA的快速少量抽提

同本节 二..1.

菌液移至5ml Eppendorf 管中,9000rpm,离心9min,去上清。

加溶液Ⅰ100μl,溶液Ⅱ200μl,溶液Ⅲ150μl,混匀,冰浴10min。

15000rpm离心15min。

吸取上清,加入异丙醇1ml混匀,置室温15~30min。

15000rpm离心15min,弃上清,加入75%乙醇洗涤2次。

离心弃上清,真空抽干,加入适量1×TE溶解DNA。

取少量DNA电泳,观察浓度。

2.转化子DNA的小量酶切鉴定 同质粒DNA的小量酶切鉴定,见本节 一。

重组子DNA的进一步鉴定

可用Southern印迹杂交法或斑点杂交法等进一步鉴定,详见本节 四。

[附]电泳洗脱法回收酶切DNA片段

用合适的酶切割DNA并电泳。

于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带,装入含1×TBE缓冲液的透析代内,用夹子封好袋口,并检查有无漏孔。

将透析袋与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳,4~5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。

取出透析袋,挤出凝胶块,吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内,10000rpm离心5min。

吸出上清放入离心管内,加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿,振荡混匀,10000rpm离心5min,吸出上清放入新的离心管内。

加入1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇,于-20℃放置4~5h。

于4℃,10000rpm离心15min,弃上清。

用75%的酒精洗涤2次,每次均于4℃,10000rpm离心5min,弃上清。

真空抽干,并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。

TAG标签: 澳门新萄京8522
版权声明:本文由澳门新萄京发布于生命科学,转载请注明出处:感受态细胞常用的制备方法